MECCANISMI REDOX DI SEGNALAZIONE CELLULARE COINVOLTI NELLA GENESI DI MALATTIE ASSOCIATE A STRESS OSSIDATIVO

Università degli Studi di PISA- PATOLOGIA SPERIMENTALE,BIOTECNOLOGIE MEDICHE,INFETTIVOLOGIA ED EPIDEMIOLOGIA – ()

Responsabile dell’Unità di ricerca

Alessandro Casini

Descrizione

Scopo di questa unità é studiare alcuni aspetti della segnalazione redox connessa con il processo apoptotico. In particolare studieremo il ruolo di una nuova classe di enzimi GSH-dipendenti, le glutatione transferasi omega (GSTO), e alcuni meccanismi che intervengono nell’omeostasi del GSH. La ricerca si articolerà nelle seguenti fasi:
A) Studio del ruolo protettivo della GSTO1 umana nei confronti dell’apoptosi. La GSTO murina é stata scoperta in virtù del fatto che essa viene sovraespressa da una linea cellulare tumorale divenuta resistente alla morte cellulare dopo trattamento con vari chemioterapici (Kodym R. et al. J. Biol. Chem. 1999, 274: 5131). Più recentemente studi di proteomica hanno dimostrato che la GSTO-1 umana é tra le proteine sovraespresse da varie linee di tumore ovarico umano in seguito all’acquisizione della resistenza al cisplatino (Yan X.-d. et al. J. Proteome Res. 2007, 6: 772). Sulla scorta di tali premesse, abbiamo condotto esperimenti preliminari, nel corso dei quali abbiamo osservato che cellule HeLa, stabilmente transfettate con il cDNA della GSTO1 umana, mostrano una notevole resistenza alla morte cellulare indotta da cisplatino. Intendiamo approfondire lo studio, caratterizzando adeguatamente la protezione offerta dalla GSTO1. L’apoptosi verrà valutata tramite il dosaggio delle caspasi 3 e 7 (processazione e attività catalitica) e la determinazione del clivaggio della PARP. Valuteremo anche, tramite immunoblotting, eventuali cambiamenti delle proteine della famiglia Bcl-2. Dato il ruolo centrale del mitocondrio nell’apoptosi, effettueremo misure del potenziale di membrana mitocondriale con appropriate sonde fluorescenti (ad es. JC1); inoltre valuteremo l’eventuale attivazione di Bax, responsabile della sua inserzione nella membrana mitocondriale, con l’uso di anticorpi contro epitopi conformazionali. Dato il potenziale ruolo della GSTO1 nel modulare lo stato redox cellulare valuteremo anche se la sovraespressione della GSTO1 comporta una riduzione dei ROS prodotti dai trattamenti sperimentali ed un effetto di modulazione sulle coppie redox GSH/GSSG e AA/DHA.
Il ruolo anti-apoptotico di GSTO1 sarà ulteriormente studiato con vari agenti apoptogeni, quali agenti genotossici, inibitori delle topoisomerasi e stimoli pro.ossidanti.
L’unità diretta dal Prof. Ciriolo ha dimostrato che i ROS o stimoli pro-ossidanti mediati da disolfuri possono dar luogo ad opposte risposte cellulari: morte o sopravvivenza. Questa dicotomia dipende dal corredo istotipo-specifico di antiossidanti ed enzimi detossificanti, di MAP chinasi e di proteine redox-sensibili. In particolar modo essi hanno dimostrato che il glutatione ossidato (GSSG) induce l’apoptosi nelle cellule U937 (Filomeni et al. FASEB J., 2003, 17:64), mentre non ha effetti citotossici sulle cellule SH-SY5Y (Filomeni et al. Free Rad. Biol. Med. 2005, 39:345). Al contrario le cellule SH-SY5Y risultano molto più sensibili nei confronti del danno mediato da ROS (Filomeni et al. Cancer Res. 2003, 63:5940) rispetto alle cellule AGS di adenocarcinoma gastrico (Filomeni et al. Cancer Res., 2005, 65:11735). In collaborazione con l’unità del Prof. Ciriolo valuteremo il ruolo della GSTO1 nella resistenza cellulare a stimoli pro-ossidanti, misurando l’espressione e l’attività della GSTO1 dopo trattamenti ossidanti o producendo linee cellulari stabilmente transfettate con il cDNA della GSTO1 umana usando il Tet-Off Gene Expression System (Clontech). Successivamente, l’effetto della GSTO sull’attivazione della via di signaling attivata dalle MAP chinasi e sulla induzione della trascrizione genica verranno studiati in collaborazione con l’unità Prof. Ciriolo.
Un diverso corredo di sistemi antiossidanti può essere alla base della diversa resistenza a stimoli ossidativi mostrata da linee cellulari di neuroblastoma sovraesprimenti o non sovraesprimenti MYCN (vedi unità diretta dal Prof. Marinari). Anche su tali linee valuteremo, in collaborazione con l’unità del Prof. Marinari, l’espressione di GSTO1 dopo trattamenti pro-ossidanti; il ruolo di GSTO1 verrà ulteriormente valutato tramite esperimenti di transfezione e/o di silenziamento (metodo “RNA interference”, Bernstein et al. Nature 2001, 409: 363).
B) Studio dei meccanismi di espressione della GSTO1. La ricerca si articolerà secondo i seguenti approcci sperimentali:
a) Studi preliminari hanno dimostrato che il trattamento di cellule HeLa e Me665/2 con TNF (noto attivatore di NFkB) é in grado di causare sovraespressione di GSTO1. Il trattamento con partenolide, inibitore dell’attivazione di NFkB, previene la sovraespressione delle GSTO1 causata da TNF. Intendiamo completare gli studi volti a definire il ruolo di NFkB nell’espressione delle GSTO1. Sempre utilizzando il trattamento con TNF, valuteremo altri inibitori dell’attivazione di NFkB, quali resveratrolo e desametasone. In caso positivo, il ruolo del NFkB verrà valutato in maniera più specifica con il metodo degli oligonucleotidi decoy (Delhalle et al. Ann. N.Y. Acad. Sci 2004, 1030:1). La sovraespressione delle GSTO1 verrà valutata tramite immunoblotting e RT-PCR. L’attivazione di NFkB verrà valutata tramite EMSA. Ulteriori esperimenti saranno condotti con la tecnica del gene reporter utilizzando il vettore pNF-kB-Luc.
b) Altri studi preliminari che riguardano i meccansimi di espressione delle GSTO umane sono stati condotti utilizzando il modello di crescita cellulare sotto forma di sferoidi, anzichè il classico monostrato. Questo modello é interessante perchè mima la modalità di crescita avascolare dei tumori solidi. In esperimenti preliminari di immunoistochimica abbiamo osservato una forte sovraespressione di GSTO1 localizzata in maniera selettiva nello strato cellulare più esterno, cioè quello maggiormente ossigenato. Sembra pertanto ragionevole supporre che la sovraespressione sia in relazione alla maggior tensione di ossigeno cui sono sottoposte tali cellule. Alternativamente la sovraespressione di GSTO1 potrebbe essere messa in relazione con la maggior attività mitotica delle cellule esterne. Quest’ultima ipotesi, tuttavia, é già stata esclusa da precedenti esperimenti: sincronizzando colture cellulari, tramite privazione di siero o blocco mitotico da nocodazolo, non abbiamo osservato alcuna correlazione tra sovraespressione di GSTO1 e particolari fasi del ciclo. Intendiamo approfondire lo studio dell’espressione di GSTO1 nel modello dello sferoide. La sovraespressione di GSTO1 verrà valutata con il metodo dell’ibridazione in situ che ci permetterà di vedere se la maggior quantità di proteina correla con un’aumentata trascrizione genica. L’eventuale attivazione di NFkB verrà determinata valutando, con metodica immunoistochimica, la traslocazione nucleare del complesso NFkB. In caso positivo l’indagine verrà ripetuta dopo trattamento delle cellule con inibitori di NFkB e con il metodo degli oligonucleotidi decoy. Con le stesse metodiche valuteremo, in collaborazione con l’unità del Prof. Ciriolo, il ruolo di ulteriori fattori di trascrizione redox-mediati, quali AP-1 e Nrf2. L’ipotesi che la produzione di ROS possa modulare l’espressione di GSTO verrà valutata trattando vari istotipi tumorali con produttori di ROS, quali perossido di idrogeno, rotenone e diallile disolfuro (DADS), o con composti tiolo-ossidanti, quali diamide, dietilmaleato e ditionitrobenzoato.
Esperimenti di verifica potranno essere effettuati incubando cellule in monostrato sotto tensioni di ossigeno diverse.
Una crescente mole di dati suggerisce il coinvolgimento di prodotti della perossidazione lipidica (soprattutto 4-idrossi-2,3-nonenale) nelle vie di signaling cellulare. Dal momento che la maggior tensione di ossigeno, cui sono sottoposte le cellule dello strato esterno dello sferoide, potrebbe produrre in tali cellule una quantità maggiore di prodotti di ossidazione lipidica rispetto alle cellule interne, valuteremo la possibilità che l’espressione di GSTO1 venga modulata da tali prodotti. La ricerca verrà condotta in collaborazione con l’unità diretta dal Prof. Poli. Eseguiremo indagini immunoistochimiche sugli sferoidi, sia utilizzando anticorpi anti-4-HNE, sia utilizzando un metodo citofluorimetrico indiretto per la rivelazione dei carbonili proteici. Valuteremo anche l’effetto di antiossidanti, quali trolox e ac. ascorbico, sull’espressione di GSTO1.
C) Studio dei meccanismi di controllo dell’omeostasi del GSH nel cristallino. La originalità di questa fase del progetto nasce dalla ipotesi, basata su recenti osservazioni ottenute dalla U.R, che la Cys-Gly possa agire da modulatore nella omeostasi del GSH. E’ stato infatti osservato in cristallini di vitello in coltura che la presenza di GSH extralenticolare, associata al blocco della gamma-glutammiltranspeptidasi (GGT), induce extra sintesi di GSH, che si accumula nel mezzo di coltura. L’aggiunta nel mezzo di coltura di Cys-Gly ma non di Cys impedisce l’accumulo di GSH, così come l’aggiunta di propargil-glicina, inibitore della cistationina gamma liasi (CGL), che agisce indipendentemente dal blocco della GGT o dalla presenza di Cys-Gly nel terreno. Ciò rende plausibile una azione di modulazione della CGL ad opera della Cys-Gly, vuoi di tipo interattivo che attraverso meccanismi di S-tiolazione. La ricerca si articola attraverso i seguenti approcci sperimentali:
a) isolamento e caratterizzazione della CGL da lenti di vitello.
La CGL verrà isolata utilizzando metodiche classiche di purificazione proteica. L’attività enzimatica potrà essere valutata utilizzando la cistationina come substrato secondo il metodo di Sastre et al. (Free Rad. Biol. Med. 2005, 38:575) oppure, nel caso di presenza di attività NADH ossidasiche interferenti con tale metodica di dosaggio (attività peraltro descritte essere presenti nelle lenti di ratto) mediante misura della Cys prodotta attraverso una specifica derivatizzazione con ninidrina in ambiente acido (Cappiello et al. Biochem. J. 2004, 378:35).
L’enzima purificato verrà sottoposto ad una caratterizzazione strutturale e funzionale. La valutazione dei parametri cinetici nei confronti della cistationina è volta a definire per l’enzima del cristallino la capacità di esplicare oltre alla attività gamma-liasica (produzione di Cys) anche quella beta-liasica (produzione di omocisteina) messe in evidenza per l’enzima di lievito e di fegato di ratto, ma non per l’enzima umano. Una tale attività potrebbe contribuire alla generazione di sulfani e quindi di acido sulfidrico che la CGL è già in grado di produrre agendo su L-cistina ed altri disolfuri. Sarà rilevante al riguardo valutare la possibilità di riconoscimento come substrati di disolfuri derivanti dalla Cys-Gly.
La capacità di generare zolfo sulfanico e acido sulfidrico verrà valutata sull’enzima puro. Alla verifica che il sistema CGL/cistina, è in grado di generare zolfo sulfanico seguirà la valutazione della capacità della CGL di indurre modifica sia su bersagli enzimatici già noti per la loro suscettibilità alla inattivazione da composti sulfanici (fosfofruttochinasi e piruvato chinasi) sia su enzimi del cristallino isolati (aldoso reduttasi, sorbitolo deidrogenasi, leucina ammino peptidasi) già disponibili alla U.R. per la sperimentazione, che su enzimi del ciclo del gamma-glutammile e del ciclo redox del GSH presenti in estratti acellulari di cristallino. L’attività dei targets enzimatici verrà misurata adottando metodologie già in uso presso l’U.R., mentre lo zolfo sulfanico prodotto dalla CGL in presenza di cistina ed eventuali altri disolfuri, nonchè quello associato ai potenziali target proteici, verrà valutato mediante HPLC con rivelatore fluorimetrico (Toohey Biochem. J. 1989, 264:625).
La possibilità di inibizione della CGL ad opera della Cys-Gly verrà valutata in diverse condizioni e con diversi substrati. Lo studio della suscettibilità all’inibizione della CGL, che oltre alla Cys-Gly si avvarrà di noti inibitori dell’enzima quali propargilglicina, amminoetossivinilglicina e trifluoroalanina, avrà tra gli obbiettivi quello di discriminare l’effetto inibente sulla attività gamma-liasica da quella producente sulfano-derivati e da quella desulfidrasica e potrebbe dare utili indicazioni sulla connessione tra metabolismo dei composti solforati, stato redox dei composti tiolici e controllo della proliferazione cellulare.
b) suscettibilità alla modifica covalente reversibile (S-tiolazione) e irreversibile (carbonilazione) della CGL.
Nell’ambito della definizione di possibili modulatori della attività CGL sarà valutata la suscettibilità dell’enzima a processi di S-tiolazione ed il loro effetto sull’attività catalitica. La reattività e accessibilità dei residui cisteinici della CGL potrà essere valutata utilizzando DTNB, acido monoiodoacetico e monobromobimano quali agenti derivatizzanti. Quali specie S-tiolanti verranno utilizzate sia omodisolfuri fisiologici (cistinil-bis-glicina, GSSG, cistina), che gli eterodisolfuri da essi derivanti (reperibili in commercio oppure sintetizzabili con metodiche già adottate da componenti l’U.R.). L’eventuale modifica verrà seguita sia monitorando cambiamenti nell’attività catalitica durante l’incubazione con la specie tiolante che, al termine del processo di S-tiolazione, previa rimozione dell’agente tiolante, valutando eventuali cambiamenti dei parametri cinetici della CGL e della sua suscettibilità all’inibizione.
L’avvenuta incorporazione del composto tiolico sarà determinata dalla valutazione sia di cambiamenti del pI della proteina che, dipendentemente dalla quantità di proteina disponibile, mediante valutazione (tramite elettroforesi capillare e/o HPLC.) del composto tiolico rilasciato dalla proteina a seguito di riduzione con DTT o ancora facendo uso di specie tiolanti radiomarcate.
Un ulteriore dato strutturale della CGL indicativo di pregresso insulto ossidativo e comunque connesso all’invecchiamento, sarà la misura dello stato di carbonilazione dell’enzima, che verrà valutato mediante OxyBlot Detection Kit. Peraltro, l’osservata diminuzione dei livelli di CGL associata all’invecchiamento, imputata ad una aumentata degradazione proteolitica della proteina, suggerisce di valutare comparativamente per le forme S-tiolate ottenute in vitro e la CGL nativa, la suscettibilità alla degradazione ad opera di varie proteasi disponibili commercialmente (incluso il proteasoma). Il problema della discriminazione tra S-tiolazione della CGL e di eventuali altri targets enzimatici e la incorporazione di zolfo sulfanico verrà affrontato utilizzando derivati solforati radio marcati caratterizzati da doppia marcatura (35S e 14C o 3H).
c) Omeostasi del GSH nel cristallino e controllo della proliferazione cellulare.
I risultati della sperimentazione in vitro sull’enzima isolato permetteranno di indagare sulla possibile relazione tra livelli di attività della CGL legati al suo stato di inibizione e/o di modifica covalente, omeostasi del GSH e controllo della proliferazione cellulare, utilizzando cellule epiteliali di cristallino e/o cristallini intatti in coltura. Alterazioni dell’omeostasi del GSH verranno indotte: i) utilizzando stress ossidativo applicato mediante aggiunte successive di perossido di idrogeno; ii) per trattamento con lo ionoforo per il calcio A23187 (calcimicina) già utilizzato per indurre apoptosi nella lente di ratto (Li et al. Exp. Eye Res. 1995, 61, 91); iii) attraverso inibitori della GGT, che si sono dimostrati capaci di indurre apoptosi in altri modelli sperimentali (Del Bello et al FASEB J. 1999, 13, 69; Lendeckel et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 252, 5).

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