Abstract

La Glutatione Perossidasi Idrossido Fosfolipide (PHGPx/GPx4) è una selenioproteina che appartiene alla superfamiglia delle glutatione perossidasi. Condivide con le altre glutatatione perossidasi il meccanismo catalitico, che comprende l’ossidazione, in presenza di un idroperossido, del selenolato del sito attivo a derivato dell’acido selenenico, la riduzione di questo da parte del glutatione (GSH) con formazione di un selenodisolfuro e quindi la rigenerazione dell’enzima nativo da parte di una seconda molecola di cosubstrato riducente (Shi et al., 2010). Tra le glutatione perossidasi, PHGPx è la meno specifica; non solo riduce un ampio spettro di idroperossidi, ma accetta anche diversi tipi di tioli come riducenti (compresi i di-tioli). La selenoperossidasi PHGPx viene descritta come enzima chiave implicato nella regolazione cellulare, nell’apoptosi, nella costruzione di strutture sopramolecolari e nel differenziamento; particolarmente rilevante appare la capacita’ della PHGPx di ossidare tioli proteici nelle fasi finali della spermatogenesi (Ursini et al., 1999). Similmente al GPx citosolico è presente in molti tessuti, ma contrariamente al GPx i suoi livelli e il suo pattern di espressione nel testicolo sono più alti che in ogni altro tessuto, incluso il fegato (Maiorino et al., 2003; Diaconu et al., 2006). Il gene umano della PHGPx è localizzato sul cromosoma 19 e risulta composto da sette esoni distribuiti su 3-4 kb di DNA (Imai e Nakagawa, 2002). Il gene è trascritto in mRNA di diversa lunghezza che danno origine a tre isoforme che indirizzano la proteina in diversi compartimenti e che differiscono per la loro estensione N-terminale: un mRNA citosolico (cPHGPx), nucleare (nPHGPx) e mitocondriale (mPHGPx) (Puglisi et al., 2005). In condizioni di potenziali redox elevati (ad es. basse concentrazioni intracellulari di GSH) e una fonte di perossidi, PHGPx catalizza l’ossidazione di specifici tioli proteici. Questa reazione è associata ad almeno due eventi rilevanti per la funzione riproduttiva: la compattazione della cromatina (Puglisi et al., 2005) e la formazione della capsula mitocondriale (Nayernia, 2002). L’isoforma nucleare in particolare, è coinvolta nel processo di condensazione della cromatina, che si verifica negli steps finali di spermatogenesi e che richiede la sostituzione della maggioranza degli istoni con proteine di transizione e protammine ritenute essenziali per la stabilizzazione del DNA e la condensazione dei spermatociti. La formazione della capsula mitocondriale richiede le “proteine ricche di cisteine associate ai mitocondri degli spermatozoi” (SMCP); infatti uno dei principali aspetti della funzione della PHGPx è la catalisi operata su cisteine adiacenti in specifiche proteine che possono funzionare come “interruttori redox” e che possono “accendere” o “spegnere” specifiche funzioni biologiche o la formazione di aggregati sopramolecolari: ciò suggerisce il ruolo del selenio nella protezione dai residui chimici libero-radicali altamente reattivi, che sono collegati alla sterilità maschile (Maiorino e Ursini, 2002). Le cause che contribuiscono ad avere soggetti infertili, prevedono a monte la valutazione del quadro ormonale: quindi il bilancio tra le azioni degli androgeni e estrogeni può essere importante ai fini del mantenimento della spermatogenesi. Tramite l’induzione della spermatogenesi, è stato provato che gli ormoni steroidei non stimolano direttamente la trascrizione genica e che, in vivo, il testosterone media l’espressione della PHGPx (Maiorino et al., 1998). Inoltre, l’espressione di PHGPx nei vertebrati mammiferi può essere controllata dagli estrogeni negli organi riproduttori maschili (testicoli, epididimo, prostata). Il 17β estradiolo, un estrogeno intrinseco nei vertebrati, ha il suo recettore espresso nei testicoli durante l’intero processo di spermatogenesi (O’Donnell et al., 2001). L’espressione del trascritto di PHGPx incrementa in seguito al trattamento con 17β estradiolo, per cui il recettore β che funziona come un regolatore dominante del segnale degli estrogeni risulta correlato con PHGPx (Pettersson et al., 2000; Nam et al., 2003). Da ciò emerge che nei mammiferi gli estrogeni esogeni influenzano il pattern di espressione del gene di PHGPx tramite il recettore β (Sang et al., 2003). Partendo da questa base scientifica ho utilizzato come modello sperimentale il maschio di un vertebrato non mammifero con tipica riproduzione stagionale, il Lacertidae Podarcis sicula il cui noto meccanismo riproduttivo è influenzato da molteplici fattori molecolari che governano le numerose ed importanti relazioni che si instaurano lungo l’asse ipotalamo-ipofisi-gonade (Guerriero, 2009). Dalla letteratura risulta ben evidente il ruolo svolto da diversi fattori endogeni ed esogeni sulla spermatogenesi del modello sperimentale oggetto della ricerca. In particolare è evidente che lo steroide testosterone eserciti un rilevante effetto regolatore sulla spermatogenesi e sullo sviluppo e funzione del sistema riproduttivo anche se la localizzazione di recettori degli estrogeni β nelle cellule del Sertoli e nelle cellule germinali suggerisce che gli estrogeni esercitino un’influenza diretta sulla funzione e maturazione delle cellule germinali (Chieffi e Varriale, 2004). Ciò solleva la possibilità che alcuni degli effetti del testosterone sulla spermatogenesi potrebbero verificarsi direttamente sulle cellule germinali dopo conversione del testosterone ad estradiolo, suggerendo una relazione funzionale tra steroidi e PHGPx. Pertanto Podarcis sicula in qualità di riproduttore stagionale si pone come modello sperimentale idoneo a definirne gli eventi che regolano la spermatogenesi a partire dalla identificazione e caratterizzazione della sequenza nucleotidica di PHGPx e dallo studio delle sue variazioni stagionali di espressione nel ciclo riproduttivo. Il progetto e’ stato pianificato in modo da ottimizzare l’integrazione di approcci biochimici con metodiche di biologia molecolare e di bioinformatica. Usufruendo della stagionalità riproduttiva del modello sperimentale, ho valutato biochimicamente la presenza e le variazioni stagionali della selenioproteina PHGPx mediante analisi di Western blotting in diversi tessuti (testicolo, encefalo, fegato e intestino) servendomi dell’anticorpo policlonale anti-PHGPx (Abnova, PAB 1206). L’analisi di Western blotting condotta, ha permesso di segnalare che l’anticorpo cross reagisce anche su tessuti di rettili evidenziando una banda del peso molecolare di circa 20kDa. L’analisi quantitativa densitometrica nei diversi tessuti conferma come per i mammiferi (Diaconu et al., 2006), una predominante espressione di PHGPx nel testicolo, con un incremento del segnale in piena attività spermatogenetica; l’intestino mostra la più scarsa attività di PHGPx nelle fasi del ciclo esaminate. Inoltre, il ciclo riproduttivo di Podarcis sicula è facilmente manovrabile, agendo su fotoperiodo e temperatura è stato possibile favorire o meno la ripresa dell’attività spermatogenetica. Ho scelto quindi di studiare l’espressione del pattern proteico di PHGPx dopo trattamenti sperimentali eseguiti rispettivamente nella fase di stasi riproduttiva e nella fase di massima attività gonadica. Il trattamento con la gonadotropina corionica umana (HCG) condotto durante la stasi riproduttiva incrementa l’immunoreattività di PHGPx dopo 21 giorni di manipolazione, mentre il trattamento con l’antagonista del recettore degli estrogeni ICI 182-780 condotto durante la massima attività gonadica induce una riduzione del segnale di PHGPx dopo 21 giorni. I risultati dei trattamenti sperimentali mettono in evidenza come, anche in Podarcis sicula, l’attività della selenioproteina PHGPx sia strettamente correlata all’attività spermatogenetica; inoltre esiste una dipendenza ormonale dell’espressione di PHGPx con gli estrogeni, che come è noto innescano il meccanismo di spermatogenesi e svolgono un ruolo fisiologico nella fertilità maschile (Carreau et al., 2011). Lo studio biochimico, come accennato, è stato integrato a quello di biologia molecolare e bioin

formatico. La regione parzialmente clonata di cDNA dal testicolo di Podarcis sicula è di 340 bp. Servendomi della metodica di PCR Retro Trascrizionale (RT-PCR), ho ottenuto una sequenza parziale: gli allineamenti condotti hanno rivelato un range di indentità nucleotidica compreso tra il 71 e l’85% nell’ambito dei vertebrati non mammiferi e tra il 76 e il 79% nell’ambito dei vertebrati mammiferi. Anche la sequenza aminoacidica dedotta di PHGPx è stata confrontata alle altre sequenze disponibili in Banca dati, rivelando un range d’identità compreso tra il 68 e il 92% nell’ambito dei vertebrati non mammiferi e tra il 79 e l’83% tra i vertebrati mammiferi. E’ interessante notare come la più bassa identità nucleotidica sia a livello dei pesci mentre sia il gene che la proteina rivelano un alto grado di identità nucleotidica ed aminoacidica con i rettili. La valutazione del livello di espressione di PHGPx è stata condotta su mRNA in varie fasi di sviluppo del testicolo con analisi semiquantitativa (SQ-RT-PCR): l’espressione testicolare di PHGPx, nel ciclo riproduttivo di Podarcis sicula, aumenta nella massima attività gonadica e diminuisce drasticamente nella stasi estiva. I differenti livelli di espressione di mRNA fanno ipotizzare che la selenioproteina PHGPx possa giocare un ruolo antiossidante anche nella spermatogenesi di Podarcis sicula (Shi et al., 2010). Il crollo di espressione di PHGPx nella stasi estiva, suggerisce che l’attività spermatogenetica possa essere inattiva per l’assenza dell’architettura del midpiece che contiene la maggior parte del selenio incorporato come residuo di selenocisteina nella PHGPx. Una proteina di 76 aa è stata dedotta dalla sequenza nucleotidica. L’approccio bioinformatico è stato, poi, utile a caratterizzare i vari domini della proteina, i motivi funzionali e a predire la struttura secondaria della proteina. I domini critici per la funzionalità di PHGPx sono pure ritrovati in Podarcis sicula segnalandone la sua appartenenza alle selenioproteine in particolare alla superfamiglia delle Tioredossine (TRXs). La valenza come antiossidante, inoltre, è ritrovata per la conservazione degli aminoacidi della tetrade catalitica triptofano (W), glutamina (Q), asparagina (N) che catalizzano la riduzione di un ampio spettro di idroperossidi ed accettano diversi tipi di tioli come riducenti (compresi i di-tioli): rilevante è la capacita’ di PHGPx di ossidare tioli proteici nelle fasi finali della spermatogenesi (Maiorino et al., 2005). Questa tesi è confermata anche dall’ analisi delle relazioni filogenetiche tra la sequenza parziale di PHGPx di Podarcis sicula e di altre specie appartenenti a diverse classi di vertebrati laddove è evidente una relativa divergenza tra le sequenze di PHGPx nei vertebrati non mammiferi e mammiferi. I risultati sulle sequenze aminoacidiche omologhe disponibili presso banche dati hanno suggerito che le regioni conservate contengono informazioni filogenetiche sufficienti per dedurre relazioni evolutive all’interno di singoli gruppi. Nei mammiferi, il ruolo della selenoperossidasi PHGPx è ben documentato in letteratura, ma l’utilizzo di bassi vertebrati, come modello sperimentale, facilita tale comprensione, data la rilevante semplicità della loro organizzazione anatomica, rispetto al modello mammifero. Per tale motivo, convinto del fatto che se un sistema biologico svolga una funzione importante e basilare nei mammiferi debba essere conservato in un basso vertebrato, mi sono avvalso del Lacertidae Podarcis sicula per lo studio del ruolo della PHGPx. In conclusione, il lavoro di tesi sull’antiossidante PHGPx nel Lacertidae Podarcis sicula ne ha permesso l’identificazione della sequenza nucleotidica, la parziale caratterizzazione, lo studio delle variazioni stagionali di espressione e la sua conservazione evolutiva. In particolare dalla letteratura è evidente l’esistenza di un’ origine locale di estrogeni nel testicolo e di un suo ruolo nell’avviare la spermatogenesi e attraverso l’analisi dell’espressione stagionale ho dimostrato un coinvolgimento di PHGPx nella maturazione degli spermatozoi e una relazione funzionale tra steroidi e PHGPx.

Fonte articolo

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